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织纹螺毒素的液相色谱法测

[导读]织纹螺毒素能溶解在1%醋酸甲醇溶液中,织纹螺经去壳取其内部肌肉和中肠腺,加入1%醋酸甲醇溶液捣碎提取和三氯甲烷去脂后,用活性炭吸附,再用生物凝胶柱分离净化,上海亚荣生化仪器厂通过反相色谱柱后衍生荧光法定量测定织纹螺毒素含量

 仪器Waters 1525高效液相色谱仪、Breeze系统色谱控制软件、Waters2475高灵敏度双扫描荧光检测器,由 Waters公司提供;PCX5200柱后衍生仪,内置100米螺旋毛细管,精度控温在0~100℃ ,活性炭小柱,由Sigma 公司提供; Bio - Gal P- 2( 2×98 cm)和 Bio- Rex70( 1 x100 cm)生物凝胶树脂纯化柱由上海生物凝胶柱研究所提供;真空旋转蒸发器SY-2000,由上海亚荣生化仪器厂提供;高速组织捣碎机,由德国Ultra - turrax 公司提供;大容量高速离心机,由德国贺利氏公司提供.

样品处理方法将织纹螺敲碎去壳,取其内部肌肉和中肠腺400.0 g,加入3倍体积的1%醋酸甲醇溶液,用高速组织捣碎机搅拌打碎5 min,在4000 r/ min下离心10 min,上清液倒入旋转蒸发瓶中,残渣用上述方法重复提取3次,合并上清液,弃去残渣。提取液在60℃下真空旋转浓缩至近100 ml,转移到100 ml分液漏斗中,加入同体积三氯甲烷,轻轻振摇2 min,弃去三氯甲烷层,重复提取3次。水层缓缓倒入已经活化的活性炭柱中进行吸附,柱滴速控制在2 ml/ min,待提取液全部过柱后滴至近干,用20%乙醇配制成含1%醋酸的解吸液50 ml进行解吸,收集全部解吸液在40℃下氮气吹干,残留物用1 mol/L氢氧化钠调节pH =5.5的少量水溶解,倒入Bio-Gal P -2柱,用3000 ml水洗涤1 次,用2000 ml的0.03 molL甲酸洗脱,洗脱液在真空旋转蒸发器中60℃浓缩至干燥,残留物用少量水溶解,溶解物加入到GPC中,GPC柱换成Bio - Rex70 ,流动相以甲酸:水,程序梯度О~0. 03 mol/L.甲酸运行30 min(可以视85%毒素流出起始点调节),流速为0. 5 ml/ min,收集第8~20 min分割液,并采用冷冻干燥,最终用1%%醋酸溶解定容至0.5 ml,经0.45 um膜过滤脱气后上机测定。标准溶液做同样处理,可从“倒入Bio - Gal P -2column柱……”开始操作。



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